Продолжение пути экспресс-метода определения токсичности на инфузориях парамециях (статья А.О. Гроздова. Журнал "КОМБИКОРМА" №6 за 2021 год)

В 1993 г. ГОСТ 13496.7-92 «Зерно фуражное, продукты его переработ­ки, комбикорма. Методы определения токсичности» был утвержден и введен в действие. Следующим был ГОСТ 13496.7-97 под тем же названием.

При создании данного стандарта ВНИИ рыбного хозяйства и океа­нографии в качестве разработчика не привлекался, в результате че­го не были устранены недостатки экспресс-метода на инфузориях стилонихиях, которые обнаружились в процессе внедрения этого метода на 450 предприятиях. Основной не­достаток — отсутствие стандартной среды культивирования инфузорий. На отстоянной водопроводной воде средней жесткости культура инфузо­рий показывала одинаковую токсикорезистентность (устойчивость к ток­сическому воздействию), но на воде с повышенной жесткостью она значи­тельно возрастала, в результате чего токсичность кормов не выявлялась. Все недостатки экспресс-метода на инфузориях стилонихиях были устранены в следующей разработке автора на инфузориях парамециях (Paramecium caudatum). Данной ра­боте была посвящена серия статьей под названием «Определение общей токсичности на инфузориях параме­циях», опубликованных в журнале «Комбикорма» в №4 за 2001 г., №5 и №6 за 2005 г. Описанный в статье экспресс-метод комплексной оценки токсичности комбикормов и сырья на инфузориях парамециях актуален и сегодня, так как прост в исполнении и дает достоверные результаты потоксичности комбикормов, предназначенных для объектов сельскохозяйственного выращивания.

Данный метод включает в себя тестирование водных экстрактов и водных растворов ацетоновых экстрактов исследуемых проб. При разработке метода на парамециях с тестированием водных растворов ацетоновых экстрактовкормовых продуктов за основу был взят метод определения токсичности на инфузориях стилонихиях по ГОСТ 13496.7-97, но отстоянная водопровод­ная вода была заменена стандартной средой Лозина-Лозинского. Парал­лельные исследования по определе­нию токсичности комбикормов, прове­денные с использованием отстоянной водопроводной воды средней жестко­сти (московская водопроводная вода) и среды Лозина-Лозинского, показали идентичность токсикорезистентности инфузорий. Для биотестирования применялись парамеции из культуры в фазе замедленного роста в возрасте от 2 до 6 недель, в течение которых токсикорезистентность инфузорий не изменялась. Практическим путем бы­ли подобраны индивидуальные дози­ровки водного раствора ацетонового экстракта кормового продукта таким образом, чтобы результаты на пара­мециях не отличались от результатов, полученных стандартным методом на стилонихиях из суточной культуры. Время экспозиции, равное двум часам, оказалось характерным для динамики токсического действия подобранных концентраций для инфузорий пара­меций на стадии замедленного роста. С увеличением времени экспозиции более двух часов гибель инфузорий не возрастала.

Для биотестирования водных экс­трактов кормов использовались пара­меции из культуры того же возраста, что и при тестировании ацетоновых экстрактов (их водных растворов). Необходимость применения водных экстрактов кормов была продикто­вана тем, что они тестировались в неразбавленном виде, а ацетоновые экстракты — при разбавлении во­дной средой минимум в 130 раз (для комбикормов: 0,3 мл ацетонового экс­тракта в 40 мл водной среды Лозина- Лозинского). В результате около 5% тестируемых образцов на водных экс­трактах токсичность выявляли, а на ацетоновых нет. В качестве примера можно привести фальсификацию сы­рого протеина в комбикормах и сырье небелковым азотом в виде карбамида или сульфата аммония, токсичность которых выявляется только при биотестировании водных экстрактов.

Метод комплексной оценки токсич­ности комбикормов и сырья позволяет выявлять токсичность в 95% случаев, при тестировании только ацетоновых экстрактов (их водных растворов) — в 90%. Для крупных свинокомплексов и птицефабрик суммарная оценка ток­сичности довольно существенна, а для небольших хозяйств, вероятно, доста­точно тестирования водных растворов ацетоновых экстрактов.

Инфузории парамеции удобны в ра­боте, так как при их культивировании исчезает проблема сохранности куль­туры, которая актуальна для стилонихий. В резервной чашке Петри культура парамеций может сохраняться без пересадки в течение года. Метод комплексной оценки токсичности по­зволяет в течение месяца проводить биотестирование на культуре инфузо­рий парамеций в фазе замедленного роста без предварительной подготов­ки тест-организмов к анализу, то есть исключая ежедневное пересаживание инфузорий на свежую среду, как в ме­тоде на стилонихиях. При этом количе­ства парамеций достаточно для того, чтобы ежедневно анализировать до 10 образцов кормов, исследуя как водные растворы ацетоновых экстрактов, так и водные экстракты исследуемых проб.

Остановимся на методических особенностях комплексной оценки токсичности комбикормов и сырья с использованием инфузорий парамеций.

Культивирование. Инфузории па­рамеции менее требовательны к усло­виям культивирования, чем другие ви­ды инфузорий. Длительное время их можно легко культивировать в чашках Петри на стандартной среде Лозина-Лозинского без дополнительного введения органических питательных веществ в виде сенного настоя, пепто­на и др. Для выведения культуры ин­фузорий в фазу замедленного роста (когда они используются для биотес­тирования) их пересаживают из ре­зервной чашки со старой культурой в чашку Петри, заполненную наполови­ну свежей средой Лозина-Лозинского, и добавляют корм — три зерна риса. Культивирование проводят с фото­периодизмом (смена дня и ночи) при постоянной температуре 24—26°С. Это можно делать или в прозрачном термобоксе, изготовленном из орг­стекла, с помощью нагревательного элемента, термодатчика и терморе­гулятора, избегая попадания прямых солнечных лучей, или в термостате, но в этом случае в нем необходимо установить маломощную лампу днев­ного света с реле времени, регулиру­ющим «день-ночь». В упрощенном варианте для создания оптимальной температуры можно использовать лампу накаливания, располагая ее на высоте по показанию термометра, на­ходящегося рядом с чашками Петри с культурой инфузорий. На ночь для затемнения чашки Петри ее со всех сторон прикрывают картоном, не до­пуская перегрева культуры.

В фазу замедленного роста культу­ра переходит через две недели со дня пересадки. В этой фазе ее можно под­держивать в течение месяца, добавляя в чашку Петри по одному зерну риса один раз в неделю. Свыше полутора месяца со дня пересадки инфузории переходят в стационарную фазу. С это­го времени их не используют для био­тестирования и чашки Петри с культу­рой переводят в разряд резервных.

В жизнеспособном состоянии культуру инфузорий в стационарной фазе мож­но поддерживать в термобоксе в тече­ние года. Для этого необходимо раз в месяц, по мере испарения среды из чашки Петри, доливать среду Лозина-Лозинского, разбавленную дистилли­рованной водой в соотношении 1:5, и добавлять по одному зерну риса.

Культивирование инфузорий и био­тестирование проводят в химически чистом помещении при температуре не выше 28°С и отсутствии даже сла­бых запахов краски, табака, парфю­мерии и других летучих химических соединений, которые могут прони­кать в чашку Петри с культурой (при­крытой стеклянной крышкой), много­кратно накапливаться в водной среде и создавать тем самым опасность для культивирования инфузорий.

Среда культивирования. В каче­стве среды культивирования исполь­зуют стандартный раствор Лозина- Лозинского на дистиллированной воде, содержащей в 1 л: NaCI в коли­честве 0,1 г; KCI — 0,01 г; CaCI₂ — 0,01 г; MgCI₂ — 0,01 г; NaHCO₃ — 0,02 г. Сре­да Лозина-Лозинского является наи­более простой по составу и в то же время достаточной для культивирова­ния инфузорий. Можно использовать дистиллированную воду, получаемую в дистилляторах, изготовленных из не­ржавеющей стали или стекла.

Дистиллированную воду отгоняют непосредственно в стерильные бутыли емкостью от 1 до 5 л с плотно закры­вающимися пробками. В этих же буты­лях готовят среду Лозина-Лозинского, добавляя по 1 мл «маточного», то есть концентрированного в 1000 раз рас­твора каждой соли на 1 л дистилли­рованной воды. Соли (CaCI₂ и MgCI₂) часто бывают в виде кристаллогидра­тов, в этом случае при приготовлении «маточного» раствора нужно произ­вести перерасчет на сухую соль (то есть увеличить концентрацию с уче­том присутствия H₂O). Хранят приго­товленную среду Лозина-Лозинского в закрытых бутылях в темном месте не более одного месяца. «Маточные» растворы хранят при тех же условиях не более шести месяцев.

Корм. Для парамеций используют термически обработанные зерна риса. Применять следует только длиннозер­ный рис с начальным сроком хранения (расфасовки). Его промывают дистил­лированной водой не менее трех раз, полностью высушивают на фильтро­вальной бумаге, прикрытой сверху также фильтровальной бумагой, и за­тем пастеризуют при температуре 80°С в течение двух часов. Готовый рис хра­нят в стерильной баночке с притертой крышкой не более шести месяцев.

Подготовка проб к биотестированию. Исходную пробу кормового продукта, независимо от степени измельчения, измельчают на лабораторной мельнице в день проведения анализа.

Приготовление ацетонового экс­тракта кормового продукта и его во­дного раствора. Навеску пробы в ко­личестве 10 г помещают в стеклянную посуду для экстракции, заливают 15 мл ацетона и экстрагируют при энергич­ном встряхивании в течение двух ми­нут. Для полного извлечения токсинов экстракцию ацетоном лучше всего про­водить в стеклянной посуде емкостью 100 мл. Для этого хорошо подходят баночки из-под детского питания на 100 г с крышкой. Если экстракционная смесь имеет кашицеобразную консистенцию (мука травяная, отруби, лузга и др.), то активная экстракция токсинов не будет происходить. В этом случае добавляют еще 5-10 мл ацетона с тем, чтобы продукт полностью находился в растворителе. После двухминутной экстракции ацетоновый экстракт от­стаивают в течение 10 мин. Это время должно быть строго фиксированным, так как оно определяет содержание мелкодисперсной взвеси продукта в экстракте. Если прошло более 15 мин, экстракт необходимо несколько раз энергично встряхнуть и дать вновь от­стояться в течение того же времени. Отстоявшийся экстракт осторожно отбирают стеклянным шприцем в ко­личестве 0,3 мл, не взбалтывая осадок, для приготовления его водного раство­ра (табл. 1).

Табл. 1 Приготовление водного раствора ацетонового экстракта в зависимости от содержания сырого протеина в пробе

Содержание сырого протеина в продукте, %	Количество среды Лозина-Лозинского, мл	Количество ацетонового экстракта, мл
25 и менее	40	0,3
26-35	50	0,3
36-45	60	0,3
46-55	70	0,3
56 и более	80	0,3
Комбикорм при хранении более двух недель со дня производства	40	0,1

Водный раствор ацетонового экс­тракта, независимо от вида кормово­го продукта, отфильтровывают через бумажный фильтр. Это избавляет раствор от крупнодисперсной жиро­вой фракции (пленки) и стандартизи­рует размер мелкодисперсных частиц продукта. Бумажные фильтры хранят в герметично закрытом полиэтилено­вом пакете.

Приготовление водного экстракта кормового продукта. Пробу в количе­стве 10 г помещают в стеклянную по­суду для экстракции, приливают 50 мл среды культивирования и энергично встряхивают в течение 2 мин. После 10 мин отстаивания ее встряхивают еще 2 мин, а затем отстаивают 15—20 мин. Образовавшуюся надосадочную жид­кость отбирают шприцем и переносят на бумажный фильтр. Если при отстаи­вании надосадочная жидкость не об­разуется или для этого требуется много времени (для экспандированных и экс­трудированных кормов, жмыхов и др.), смесь центрифугируют 5 мин с часто­той вращения 1000 об/мин, после чего полученную надосадочную жидкость фильтруют через фильтровальную бумагу. При фильтрации центрифугата избавляются от крупнодисперсной жировой фракции, в противном случае фильтрат и нефильтрованный центрифугат одной и той же пробы при тестировании могут дать различные результаты. После фильтрации проба готова к биотестированию. Она содержит водорастворимые фракции токсинов и мелкодисперсную взвесь – частицы размером около 5 мкм.

Испытание водного раствора аце­тонового экстракта. Для биотести­рования используют блок луночных микроаквариумов, схожий с тем, что указан в ГОСТ 31674-2012 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсично­сти» в пункте 4.1.2.1. Блок луночных микроаквариумов должен быть разме­ром 15 х 8,5 х 1 (или 1,3) см. В пласти­не девять рядов по пять полированных или оплавленных стеклодувной горел­кой лунок, расположенных поперек пластины. Каждый ряд предназначен для биотестирования одной пробы. Четыре лунки в ряду используют для биотестирования водного раствора ацетонового экстракта, а пятую (ниж­нюю) — для биотестирования водного экстракта исследуемой пробы.

Среду с инфузориями из чашки Пе­три вносят пипеткой (кончик необхо­димо ополоснуть в баночке с чистой средой) во все испытуемые микроак­вариумы по две капли, поэтапно. Сна­чала вносят по одной капле в каждую лунку по направлению вдоль блока луночных микроаквариумов (ряды с пробами расположены поперек) та­ким образом, чтобы последующая капля попадала в лунку следующей по порядку пробы. Это связано с тем, что инфузории, независимо от видовой принадлежности, образуют в чашках Петри обособленные клональные скопления, обладающие различной токсикорезистентностью. Эти скопле­ния хорошо заметны в суточной культуре стилонихий. Парамеции в чашках Петри концентрируются под зернами риса и вокруг него. Для их отбора не­обходимо кончиком пипетки сдвинуть рис в сторону и равномерно забрать скопление инфузорий в пипетку. За­полнив все лунки, аналогично вносят вторую каплю. При дробном внесении инфузорий в микроаквариумы достига­ется равномерное распределение раз­ночувствительных инфузорий в лунках каждой пробы. В каждой из четырех лунок пробы должно находиться око­ло 10 инфузорий. После этого приго­товленные ранее водные растворы аце­тоновых экстрактов испытуемых проб еще раз перемешивают взбалтыванием и вносят опытной пипеткой в каждый микроаквариум по десять капель.

Подсчет инфузорий проводят через два часа экспозиции при легком посту­кивании пальцем по блоку микроаква­риума. Сначала регистрируют только подвижных парамеций (это выжившие), к ним прибавляют неподвижно лежа­щих на дне микроаквариума мертвых парамеций (погибшие парамеции за два часа не подвергаются полному лизису) — в сумме это численность по­садки. Подсчет парамеций проводится значительно проще, чем стилонихий. Это связано с меньшей мутностью ис­следуемой пробы, так как дозировка ацетонового экстракта для парамеций ниже. После подсчета рассчитывают процент выживших инфузорий и опре­деляют степень токсичности исследуе­мого продукта.

Тест-критерий токсичности кормового продукта. Проба нетоксична для птицы и свиней при 81-100%-ной выживаемости парамеций, для поросят, свиноматок и цыплят – при 91-100%-ной. Проба слаботоксична для птицы и свиней при 51 —80%-ной выживаемости инфузорий, для по­росят, свиноматок и цыплят — при 51—90%-ной. Проба токсична, если выжило 0-50% инфузорий.

Испытание водного экстракта кормового продукта проводят в пя­том (последнем в ряду) микроаквариу­ме. В него вносят пипеткой из чашки Петри пять капель среды с парамеция­ми (кончик необходимо ополоснуть в баночке с чистой средой), а затем пять капель подготовленной для тестиро­вания пробы. При исследовании не­скольких проб инфузорий вносят сначала по одной капле в лунки всех испытуемых проб и так продолжают, пока не внесут все пять капель в каж­дую лунку (пробу). При тестировании повторности необязательны, так как анализ качественный.

Оценка токсичности. Токсичность пробы оценивают по времени, за ко­торое происходит гибель инфузорий. Проба остро токсична — гибель до 30 мин, токсична — от 31 до 60 мин, слаботоксична — от 1 ч до 3 ч, неток­сична — инфузории за 3 ч не погибли. В случае гибели инфузории становят­ся неподвижными, оседают на дно микроаквариума и при постукивании пальцем по блоку их движение не на­блюдается (см. схемы определения токсичности).

Использование экспресс-метода при комплексном определении ток­сичности комбикормов ограниче­но двумя случаями: тестированием ацетонового экстракта стартерных (престартерных) комбикормов для поросят и телят, содержащих аро­матизаторы, и тестированием водных экстрактов комбикормов для свиней, содержащих подкислители (органи­ческие кислоты) — и в одном и в другом случае метод дает псевдоток- сический эффект. О том, как устра­нить этот недостаток, будет изложе­но в следующей статье при анализе ГОСТ 31674-2012 «Корма, комбикор­ма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности» с Изменением №1 (введен в действие на территории РФ 01.07.2017).

Схемы определения токсичности на водных и ацетоновых экстрактах

Схема экспрессного определения токсичности комбикормов и сырья на ацетоновых экстрактах:

1)    измельчить пробу в лабораторной мельнице в день проведения анализа;

2)    навеску пробы в количестве 10 г поместить в баночку для экстракции;

3)    внести 15 (20) мл ацетона пипеткой и плотно закрыть баночку крышкой;

4)    встряхивать содержимое баночки в течение 2 мин;

5)    отстаивать 10—15 мин, предварительно ослабив крышку баночки;

6)    отобрать 0,3 мл ацетонового экстракта стеклянным шприцем и перенести в химический стакан (баночку) со средой Лозина-Лозинского, количество ко­торого зависит от содержания сырого протеина в пробе (таблица);

7)    перемешать пробу и отфильтровать через бумажный фильтр, полученный фильтрат готов к биотестированию;

8)    отобрать инфузории из чашки Петри пипеткой (кончик ополоснуть в баноч­ке с чистой средой) и поместить по одной капле в каждый микроаквариум;

9)    проверить наличие инфузорий в каждом микроаквариуме и добавить еще по 1 капле с инфузориями (если инфузорий менее 8 шт.) или по 1 капле чистой среды (если инфузорий более 8 шт.) указанным выше способом;

10) внести в каждый микроаквариум соответствующего ряда по 10 капель под­готовленной для тестирования пробы, записать время начала экспозиции;

11) провести подсчет инфузорий через два часа экспозиции, регистрируя выживших инфузорий и численность посадки (выжившие + погибшие инфу­зории, лежащие на дне микроаквариума);

12) определить выживаемость инфузорий в процентах и степень токсичности пробы.

 Схема экспрессного определения токсичности комбикормов и сырья на водных экстрактах:

1)    измельчить пробу в лабораторной мельнице в день проведения анализа;

2)    навеску пробы в количестве 10 г поместить в баночку для экстракции;

3)    внести 50 мл среды Лозина-Лозинского и плотно закрыть баночку крышкой;

4)    встряхивать содержимое баночки в течение 2 мин;

5)    отстаивать 10—15 мин;

6)    встряхивать второй раз в течение 2 мин;

7)    отстаивать 15—20 мин, предварительно ослабив крышку баночки; если надосадочная жидкость не образуется, разлить в две центрифужные пробирки и центрифугировать в течение 5 мин;

8)    образовавшуюся надосадочную жидкость отобрать шприцем и поместить в бумажный фильтр быстрой фильтрации: центрифугат также необходимо от­фильтровать через бумажный фильтр; полученный фильтрат готов к биоте­стированию;

9)    отобрать инфузории из чашки Петри пипеткой (кончик ополоснуть в ба­ночке с чистой средой) и поместить по 1 капле в каждый микроаквариум ниж­него ряда блока микроаквариумов по количеству тестируемых проб; повторить данную операцию еще четыре раза для того, чтобы общее количество капель с инфузориями в каждом микроаквариуме было равно 5;

10) просмотреть под микроскопом все заполненные микроаквариумы; при наличии хлопьев корма удалить их пипеткой, заполнив отобранную часть чи­стой средой также пипеткой

11) внести в каждый микроаквариум по 5 капель подготовленной для те­стирования пробы в соответствии с номером по порядку, указанном в бланке проведения анализа; записать время начала экспозиции в бланк;

12) определить время гибели инфузорий и степень токсичности, просматривая микроаквариумы под микроскопом через 30 мин, 1 ч, 2 и 3ч с начала экспозиции.